百创汇/报道
什么是DNA甲基化
DNA甲基化(DNA methylation)是基因表观遗传学的重要机制之一,表观遗传学是指“研究基因的一级核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达发生可遗传的变化的一门学科”。现在用于泛指不由DNA序列的变化所引起的可遗传的基因表达的改变。DNA甲基化异常是目前研究最充分的表观遗传修饰方式。
|
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶能在G(鸟嘌呤)前面的C(胞嘧啶)5′碳原子上共价催化地加上“甲基”。产生5-甲基胞嘧啶(5-mc)。大约50%的人类基因启动子区富含“C-G序列”也叫(CpG二核苷酸)。正常的健康细胞中“CpG富集区”经常处于“未甲基化状态”。而在人类基因组的其他大部分区域却相对缺乏CpG序列,人类基因组的大部分CpG二核苷酸“处于甲基化状态”。
甲基化发生区域:CpG岛的概念
某些区域CpG序列的密度比平均密度高10~20倍,GC含量大于50%,长度大于200bp的区域,称为CpG岛:一段超过200bp,GC含量大于50%,CpG比值(观测值/期望值,Obs/ExpCpG=CpG的数目/(C的数目/G的数目)*N,N代表所分析序列中核苷酸总数)大于0.6的DNA区域。
基因调控元件(如启动子)所含CpG岛中的5mC会阻碍转录因子复合体与DNA的结合。
目前认为基因调控元件(如启动子)的CpG岛中发生5mC修饰会在空间上阻碍转录因子复合物与DNA的结合。因而DNA甲基化一般与基因沉默相关联(DNA甲基化一般与基因沉默相关联;非甲基化一般与基因的活化相关联;而去甲基化往往与一个沉默基因的重新激活相关联)。
DNA甲基化的生物学作用
DNA甲基化在维持正常细胞的功能、雌性个体X染色体失活、寄生DNA序列的抑制、基因组结构稳定、遗传印记、胚胎发育、及肿瘤和疾病的发生、发展紧密相关,具有至关重要的作用。
1、DNA甲基化与肿瘤发生
肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变,其特点是总体甲基化水平的降低与局部甲基化水平的升高。在肿瘤细胞中,癌基因处于低甲基化状态而被激活,抑癌基因处于高甲基化状态而被抑制。癌症是从一个单细胞开始的,这个细胞经历了许多变化,使得其表型与它正常的前体不同。尽管这个过程可以由控制细胞生长的关键基因所驱动,但许多表达的变化可能是由于表观遗传改变(主要是DNA甲基化)。
这些DNA甲基化变异从何而来?
一个主要的特征是:肿瘤甲基化图谱的产生模式与正常细胞衰老过程中甲基化图谱的产生模式几乎相同(但增加的幅度更大),表明这些甲基化特征在转化成肿瘤细胞前的初始细胞中已经在某种程度上存在。事实上,甲基化的这种基本改变很可能与复制一起,在肿瘤形成前细胞生长的克隆选择中起作用。支持这一观念的是,研究者观察到任何组织一生患癌的风险与正常组织中异常老化有关的甲基化变异的程度直接相关。例如,结肠细胞的异常甲基化的程度相对较高,且易患癌症;但神经细胞极少异常甲基化,发生肿瘤的风险也较低。除了加速老化相关的异常甲基化这一基本而主要的表观遗传特征以外,癌细胞也会发生由肿瘤微环境或在细胞甲基化管理机器中起作用的基因的体细胞突变所诱导的甲基化变化。比如,高比例的脑胶质瘤中异柠檬酸脱氢酶突变、髓系恶性肿瘤中TET突变、急性髓系白血病中DNMT3A突变,均会对DNA甲基化产生影响。
这些联合的表观遗传事件的总体影响是改变基因表达模式:允许致癌基因表达,或阻止参与生长抑制、分化或DNA损伤响应的基因激活。
因此,尽管DNA甲基化可能并不在所有癌症中起主导作用,但毫无疑问的是,这些修饰模式的变化最终会影响细胞的易感性和肿瘤表型。这些观念导致研究者开发出一些去甲基化的药物(如氮杂胞苷),在治疗特殊肿瘤方面很有用。这些药物也可以通过引起被抑制的肿瘤抗原的去甲基化,及扭转-T细胞耗竭,来增加癌症免疫治疗的疗效。此外,选择性靶向甲基化畸变可以提供癌症有效的治疗或预防措施。
2、DNA甲基化与遗传物质的稳定性
研究证明,细菌DNA复制起始与DNA甲基化及DNA与细菌质膜的相互作用有关,DNA甲基化作为一种标签决定了复制起始点,控制了复制起始,使得DNA复制与细胞分裂保持一致;DNA错配修复是细胞增殖过程中纠正DNA复制错误的重要手段。复制后双链DNA在短期内(数分钟)保持半甲基化状态,错配修复系统从而能够区分旧链与新链,为新链中掺入的错误碱基提供了分子标记。
3、DNA甲基化与基因表达调控
DNA甲基化为非编码区(如内含子等)的长期沉默提供了一种有效的抑制机制。基因启动区域内CpG位点的甲基化通过三种方式影响基因转录活性:DNA序列甲基化直接阻碍转录因子的结合;甲基CpG结合蛋白结合到甲基化CpG位点与其他转录抑制因子相互作用;染色质结构的凝集阻碍了转录因子与其调控序列的结合。
4、DNA甲基化与胚胎发育
在胚胎发育的过程中,基因组范围内的DNA甲基化水平会发生剧烈的改变,其中,改变最为剧烈的是配子形成期与早期胚胎发育阶段。错误甲基化模式的建立可能会引起人类疾病,如脆性X染色体综合征。
DNA甲基化与癌症早筛
首先,什么是cfDNA(Cell-free DNA,即血浆游离DNA)?cfDNA是外周血中游离存在,cfDNA是从自然或非自然死亡的细胞中释放的DNA。这些cfDNA从血液中被清除只需要很短的时间,仅仅几个小时就够了。因为不断有细胞死亡,也就不断有cfDNA被清除。病毒携带者血液中的病毒DNA亦属于cfDNA范畴。cfDNA可由正常细胞、异常细胞(如肿瘤细胞),病毒携带者血液中的病毒DNA产生。对于孕妇来说,外周血中还存在着胎儿的游离DNA。
ctDNA (circulating tumor DNA循环肿瘤DNA)是属于血液循环游离 DNA(cell-free DNA)的一种,所占比例在0.01%-90% 左右。
正常细胞发生癌变,变成肿瘤细胞。肿瘤细胞也会经历“生老病死”,肿瘤细胞中的物质可能释放到血液中,比如肿瘤细胞的 DNA,它们随着血液循环而流动,这也就是我们所说的循环肿瘤 DNA(ctDNA)。
目前,ctDNA 是热门的早筛标志物,DNA 甲基化是全球肿瘤早筛的主流技术路线。甲基化是肿瘤从癌前向癌症突变临界点转变的指标,能够在ctDNA( 肿瘤患者血液中游离的来自肿瘤的DNA,而癌症相关基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改变是肿瘤细胞的一个重要特征) 的水平上,用一管血扫描多达几百万个不同的甲基化位点,从而找到特异性的癌症标志物,并在此基础上开发高灵敏度的检测方法。甲基化还能够解决另外一个癌症筛查中的难题——器官溯源。因为人体的不同器官有自己特异的甲基化谱,这可以帮助在发现早期癌症预警的同时,也可以初步推断癌症来自哪个器官。
液体活检成功的希望是测试血浆中的循环肿瘤DNA(ctDNA)。GRAIL和Freenome两家公司正在努力开发针对ctDNA的癌症筛查测试。其中GRAIL已投入了数十亿美元。
此外,目前液体活检开发者和治疗选择提供者也在不断前进。Guardant Health 在2018年10月中旬成功首次公开募股,并宣布了研究中的好消息。Foundation Medicine的液体活检(现更名为FoundationOne Liquid)作为“突破性技术”快速通过了FDA审批。
所有这些大公司都在寻找指示癌症的驱动突变。例如MET基因可在癌症中扩增;因此如果检测到MET基因的水平高于其他“正常”基因的基线水平,这就是个体患有癌症的信号。
迄今已经发现约140个癌症基因突变后可以驱动肿瘤发生;而这些基因可以受到多种突变的影响,这意味着多种单一突变(如单核苷酸变异、插入与缺失、拷贝数变异、结构变异)的数量会比较大。尽管如此,从功能上而言,作为肿瘤抑制基因的TP53可以被多种方式灭活;因此作为癌症标志物的TP53去抑制也是癌症可以发生的140种方式之一。
什么是ctmDNA?以前没有测过ctmDNA吗?
通过观察ctmDNA(循环肿瘤甲基化DNA),癌症信号的'搜索空间'从140个基因增加到数千,增加了几乎100倍。而且你可以'看到'整个基因网络的打开和关闭。因此在寻找ctRNA标志物的同时(Predicine是一家将cfDNA与cfRNA分析结合起来的公司),cfDNA中的甲基化标记物为查找疾病特征信号提供了一种极具吸引力的新方法。
拥有100倍以上的标志物意味着ctmDNA具有内置冗余,也就是说,即使癌症的“网络式”信号中有单个节点缺失,整个网络仍然能够被识别。这就好比一个有1,400块的拼图,其中有一块或十块缺失,你仍然可以识别整张照片。
甲基化研究历史悠久。以往流行多年的方法是焦磷酸测序以及甲基化特异性实时PCR。诸如Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip的微阵列实现了更广泛的甲基化测量范围。随着NGS的出现,称为RRBS(简化亚硫酸氢盐测序)的全基因组方法进一步扩大了范围,能够分析大约400万个CpG位点,大约是基因组中所有甲基化位点的三分之一。
而全基因组甲基化测序虽然技术上可行,但是因为无法对基因组内感兴趣的目标CpG区域进行选择,使得测序总成本过高。
有了所有这些技术,为什么cfDNA甲基化作为一种潜在的癌症生物标志物还是没有普及呢?这主要是因为在甲基化检测过程中还有两个技术限制。
首先是亚硫酸氢盐处理。它通过化学反应将DNA中未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶,后者在测序中作为胸腺嘧啶被读出;但是亚硫酸氢盐严重损伤DNA。所以如果一开始可用的循环肿瘤DNA很有限,那么经过处理后很可能无法检测到任何DNA突变。
第二是测量方法。微阵列和实时PCR测量的是单个CpG,会丢失单倍型信息(如在DNA链上的相邻关系,即一条连续的DNA链上多个CpG位点的甲基化状态)。焦磷酸测序和RRBS会读出这些信息,但是在数据的生物信息分析中,这些信息往往在第一步就被丢弃了。
鹍远基因检测cfDNA的甲基化单倍型
通过测量cfDNA中的ctmDNA,鹍远基因已经能够观测20,000个甲基化单倍型信号(这一数字会随着技术进步继续增加),从中进一步观察外周血中上调或下调的整体基因网络。
在研究癌症组织样品时,小批量(约数十个)癌变和健康组织将以非靶向的通用的甲基化单倍型分析流程进行分析。鹍远基因的标准生物信息学分析流程将NGS数据中的甲基化单倍型信号,按照良性组织和恶性组织分组构建分类器,并选择鉴别两组样本的甲基化单倍型。
鹍远基因还可以较为方便地定制测试:它可以用于检测更大批量的恶性和健康组织样本,以进一步改进分类器;也可以用于检测临床样品。我们将在以后进一步介绍此类测试的细节。
现在鹍远基因为市场提供了一种用于研究新型生物标志物的新工具。使用这一工具开发的泛癌筛查(PanSeer)和结肠直肠癌筛查(ColonES)的结果令人印象深刻,提示是一个好的开始,而未来更加值得期待。
预告
2021年4月8~11日,“ 第三届世界大健康博览会暨医疗器械展” 将在武汉举办。鹍远生物受邀参展,将携常艾克TM肠癌多基因甲基化检测、PanSeeer泛癌早筛血液无创基因甲基化检测等鹍远生物自主研发的癌症早筛明星产品服务亮相展会,助力国民健康生活,共同构建健康中国。
第三届世界大健康博览会暨医疗器械展场馆分布
鹍远生物诚邀您拨冗莅临A3馆T36展位!
EDITOR'S PICK
(来源:腾讯)